文 | 凡觀紀實

編輯 | 凡觀紀實

?——【·前言·】——?

自1975年以來，植物生長調節劑甲基吡枯氯化物已在全球范圍內用于抑制過度營養生長，加速作物成熟并避免棉花生產中的產量損失。

除了操縱植物冠層結構外，在棉花種子中施用MC還可以通過增加側根的數量來增加棉花根系的生長，并提高抗旱性。

一些研究報告說，MC是一種赤霉酸抑制劑，通過控制GA生物合成和代謝基因表達降低內源性GA水平來降低棉花株高。

一、MC對LR增長的影響因素

GA抑制劑或GA缺乏不僅會干擾GA的內源性水平，還會干擾其他植物激素的內源性水平。GA缺陷轉基因楊通過與吲哚-3-乙酸的相互作用表現出增加的LR密度和長度。

Mauriat表明，應用多效唑通過提高雜交白楊插條基部3mm處的IAA水平，顯著增加了不定根的數量。眾所周知，IAA是植物LR生長的關鍵調節因子。

根系對植物發育至關重要，主要通過LR形成分枝決定。因此，我們認為MC促進LR增長可能與IAA水平的變化有關。

二、IAA調節LR發育的方式

IAA通過誘導生長素反應因子7和ARF19表達來調節LR發育，從而激活下游基因，例如側器官邊界-域/不對稱葉2樣家族的成員，活性游離IAA源自從頭合成和IAA偶聯物水解。

后者是發芽種子中IAA的主要來源，例如，在玉米和擬南芥中，通過水解儲存在種子中的偶聯物快速發芽，為發育中的幼苗提供游離的IAA。

植物組織中的大多數IAA在其羧基處通過酯鍵與糖部分結合，并通過酰胺鍵與氨基酸或肽偶聯。在雙子葉植物中，IAA的酰胺綴合物優于酯綴合物。

IAA-天冬氨酸和IAA-谷氨酸是IAA分解代謝的中間體，而其他偶聯物，包括IAA-丙氨酸和IAA-亮氨酸，可作為IAA穩態控制激素濃度的儲備形式。

三、IAA代謝和信號傳導的作用

IAA酰胺水解酶從其酰胺偶聯物中釋放游離IAA，因此可能在調節雙子葉植物的活性游離IAA水平方面發揮重要作用。

幾種IAHs及其相應的編碼基因最初在擬南芥中被表征。第一種分離的酶ILR1優先在體外切割IAA-Leu和IAA-苯丙氨酸，而ILL1，ILL2和IAR3酶更喜歡IAA-Ala作為底物。

此外，另外24個IAH在擬南芥的IAA-酰胺偶聯物上沒有活性。在其他種屬中也檢測到活性IAH直系同源物，如菜豆、蕓苔屬、小麥和荸薺。

本研究旨在評估IAA代謝和信號傳導在MC誘導的棉花幼苗LR數量增加中的作用。假設用MC處理棉花種子將通過加速IAA共軛水解來提高IAA水平，從而增加LR的數量。

我們確定了MC對LR發育過程中內源性IAA和IAA-酰胺偶聯物水平以及編碼IAA信號元件和IAHs的基因表達模式的影響。克隆棉花中編碼IAHs的基因，并在體外進行功能表征。

開發了針對IAHGhIAR3a的兔多克隆和小鼠單克隆抗體，并通過已建立的夾心酶聯免疫吸附測定檢測MC對GhIAR3a蛋白水平的影響。

四、MC對棉花IAH基因表達的作用

在棉多毛中發現了2種GhIAH家族的蛋白質。將GhIAH家族蛋白質與AtIAH家族所有成員進行比較的系統發育分析證實，大多數與AtIAR1相似。

GhILR3，GhILL6a/b和GhILL1a/b蛋白分別與AtILR3，AtILL6和AtILL5蛋白相似，PCR結果顯示，棉花種子萌發過程中表達GhILR1、GhILL3a、GhILL6b、GhIAR3a和GhIAR3b。

GhILR1、GhILL3a和GhILL6b蛋白的氨基酸與AtILR53、AtILL58和AtILL62蛋白的一致性分別為1%、3%和6%。

GhIAR3a和GhIAR3b分別顯示出63%和64%與AtIAR3的一致性，GhIAR3a和GhIAR3b的相同性為83%。

MC處理后幼苗中GhILR1、GhILL6b、GhIAR3a和GhIAR3b的相對表達顯著增加，在處理后1-6小時，GhILR10和GhILL34b的相對表達分別增加了0-24.1%和83.3-6.9%。

處理后3–3h棉花幼苗中GhIAR27a和GhIAR0b的表達量分別增加了55.2–8.7%和67.2–6.18%。然而，ILL6酶對擬南芥中的IAA酰胺沒有活性。

因此，基于表達譜，選擇GhILR1，GhIAR3a和GhIAR3b進行功能驗證。空間表達結果表明，這些基因均在棉花子葉、下胚軸和根部表達。

五、GhIAH的克隆和功能分析

克隆了GhILR1，GhIAR3a和GhIAR3b cDNA。 預測的氨基酸與G.hirsutum，棉屬和棉植物園的直系同源物對齊，其基因組已被測序。

這些序列顯示出與G.hirsutum D亞基因組的最高同一性，GhILR1、GhIAR3a和GhIAR3b分別包含428、444和443個氨基酸。

GhIAR3a和GhIAR3b可能位于含有RDEL/HEDL序列的內質網中，該序列發出將植物蛋白檢索到ER腔的信號。

此外，兩者都具有可切割的N端信號序列，并且根據預測結果，成熟蛋白將從GhIAR24a和GhIAR3b的密碼子3開始。GhILR1還具有可切割的N端信號序列。

GhIAR3a和GhIAR3b在大腸桿菌中作為谷胱甘肽S-轉移酶標記的融合蛋白表達，而GhILR1在大腸桿菌中作為His標記的融合蛋白表達。

通過不同的IAA-酰胺偶聯物測試純化的GST-GhIAR3a，GST-GhIAR3b和His-ILR1的IAA偶聯物水解。

所有三種水解酶都裂解了幾種IAA-酰胺偶聯物，包括IAA-Gly，IAA-Leu，IAA-Met和IAA-Phe，只有GST-GhIAR3a有效地水解IAA-Ala。純化的GST沒有水解任何這些偶聯物。

六、IAR對MC治療的反應

為確定IAR3基因是否是幼苗期MC對LR形成影響的原因，研究了擬南芥iar3突變體和哥倫比亞0野生型植株在100μMMC處理下的表型。

擬南芥iar3突變體在AtIAR3啟動子中具有T-DNA插入。GhIAR3a和GhIAR3b的氨基酸序列與AtIAR3蛋白的氨基酸序列最相似。

GhIAR3a的酶分析顯示，GhIAR3a優先水解IAA-Ala，這與擬南芥AtIAR3的結果一致。在Col-38野生型幼苗中，LR數量在6dat時顯著增加10.0%。

而在iar7突變型幼苗中僅增加了8.3%，這些結果表明，GhIAR3可能在響應MC處理的棉花幼苗LR形成中發揮重要作用。

七、LR數增加的因素

MC應用于棉花種子可以通過增加根長和LR數量來增加根系生長。我們的數據證實了這些現象，表明MC處理誘導了LR數量和伸長率的增加。

一些研究報告，LRs位點的確定發生在LRP可見開始之前。此外，MC處理幼苗的LRI分裂比對照幼苗更早發生，表明LR數增加主要是MC處理幼苗LRI增加的結果。

八、IAA偶聯物的水解的影響

IAA在調節LRI期間周周期細胞的啟動和分裂中起核心作用。然后激活IAA轉錄因子ARF7和ARF19并調節其靶基因的轉錄，例如LBD16和LBD18。

MC顯著提高了棉花根系啟動區IAA水平，并持續上調MC處理棉幼苗根系中GhARF7、GhARF19、GhLBD18–1和GhLBD18–2的表達。

IAA偶聯物的水解是發芽種子和發育幼苗中IAA的主要來源。在這項研究中，在棉花種子發芽期間觀察到IAA-酰胺偶聯物的明顯快速水解。

顯示IAA-Phe，IAA-Met，IAA-Ala偶聯物的水平顯著降低，與對照幼苗相比，MC處理幼苗中IAA-酰胺綴合物含量降低。

這一發現表明，響應MC處理的IAA含量增加可能是通過加速IAA-酰胺偶聯物的水解來實現的。IAH基因已在許多植物物種中鑒定，包括裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。

迄今為止，在AtIAH家族中已經鑒定出1個基因：ILR1、ILL2、ILL3和IAR22，它們編碼的酶可以在體外在一定程度上切割IAA-酰胺偶聯物。

ILL6和ILL1/GR5，它們沒有這種催化活性;和ILL23，它被認為是一個假基因。數據庫檢索證實，在G.hirsutum中假設有1個GhIAHs，并且與AtIAHs具有高度的同源性。

結果表明，GhILL3、GhILR3、GhIAR5a和GhIAR33b的相對表達在MC處理幼苗中上調。接種中華根瘤菌和胚內球瘤菌后，MtIAR28和MtIAR3基因表達顯著上調。

此外，它們的水解酶活性增加，Br-IAR627和Br-ILL35基因在大白菜受感染根癭中的表達發生改變。

九、融合蛋白的生成和純化

GhIAR3a和GhIAR3b在大腸桿菌中表示為與GST標簽的N末端的融合，而GhILR1融合到His標簽的N末端。

pGEX-IAR3a和pGEX-IAR3b重組基因是通過在cDNA中的密碼子23-24處引入EcoRI位點并將EcoR I-SalI片段亞克隆為pGEX-4T-1而生成的，該片段用相同的限制性內切酶切割。

將重組基因pET30-ILR1亞克隆到pET30a載體中。在細胞質蛋白表達方面，通過熱休克法將構建體轉化為大腸桿菌菌株BL21。

將轉化細胞的單個菌落接種在5mLLB中，以30rpm振蕩過夜。之后，將200.1mL過夜培養物轉移到2mLLB中，并在120°C振蕩30~7小時。

通過加入8.0mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷在3°C振蕩過夜來誘導培養物。如前所述純化蛋白質并儲存在-23°C直至分析。這些蛋白質后來通過分光光度法定量。

十、總結

甲基吡枯氯化物是一種植物生長調節劑，廣泛用于棉花生產，以抑制過度營養生長、增加根系生長并避免產量損失。

為促進根系生長，采用MC處理棉花種子，增加側根數量，提高抗旱性。增加的吲哚-3-乙酸池似乎與LR生長相關，發芽種子中IAA的主要來源是IAA偶聯物。

研究了IAA穩態和信號傳導在MC處理的棉花幼苗中的作用。本研究顯著提高了根系內源IAA水平，通過上調GhARF7/19和GhLBD18s，進而增加LR數量和伸長率，促進了側根起始。

與未處理的對照幼苗相比，MC處理幼苗的IAA-酰胺綴合物水平顯著降低。鑒定棉花IAA酰胺水解酶基因家族的3個成員。

其中GhIAR3a、GhIAR1b、GhILL6和GhILL3在棉花種子萌發過程中表達。 與未處理對照幼苗相比，MC處理幼苗中GhIAR3a、GhIAR1b、GhILR6和GhILL3的表達水平顯著升高。

克隆GhIAR1a/b和GhILR3基因并在大腸桿菌中表達，這些重組蛋白表現出水解活性，可以在體外裂解IAA-苯丙氨酸、IAA-蛋氨酸、IAA-甘氨酸和IAA-亮氨酸。

而只有GhIAR3a能有效地水解IAA-丙氨酸，與未處理的對照幼苗相比，通過已建立的夾心酶聯免疫吸附測定法檢測到的GhIAR3a含量在MC處理的幼苗中有所增加。

擬南芥iar突變體對MC誘導的LR生長的反應不如野生型。

MC應用可以通過加速IAH基因表達，通過增加IAA-酰胺偶聯物水解的IAA水平來介導IAA穩態，從而促進LRI并增加LR的數量和伸長率。

MC的應用增加了內源IAA含量，通過上調GhARF7/19和GhLBD18s并促進了LRI，從而增加了LR數和伸長率。

MC上調了GhIAR3a、GhIAR3b和GhILR1的表達，它們編碼的酰胺水解酶可以切割IAA-Phe、IAA-Met、IAA-Leu和IAA-Ala，以在體外游離IAA，加速IAA-酰胺偶聯物的水解。

在棉花幼苗中產生更多的IAA。這些結果表明，MC的應用可以介導IAA和IAA共軛穩態，促進LR發展。

此外，與對照幼苗相比，MC處理幼苗中的GhIAR3a含量也有所增加，通過已建立的夾層ELISA顯示。

擬南芥iar3突變體對MC誘導的LR發展的反應降低。這些發現為響應MC的LR數量增加的分子理解提供了新的見解。需要進一步的研究來研究MC如何調節IAH基因。